文章来源：中华精神科杂志, 2022,55(3) : 204-213
作者：滕紫薇 苏钰涵 覃月 陈晋东 唐慧 吴仁容 伍海姗 黄兢
摘要
目的
通过比较不同时期大脑类器官脑区分化和神经细胞标志物的改变，分析萝卜硫素对大脑类器官发育的影响及可能机制。
方法
使用萝卜硫素处理人诱导多能干细胞分化形成的大脑类器官。实验组为不同浓度（1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L）萝卜硫素处理组，对照组为空白对照组，每组20个类器官。采用免疫荧光、苏木精-伊红染色法观察比较萝卜硫素处理后不同时期脑区标志物和神经细胞标志物表达特点；RNA测序分析差异表达基因并进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析；实时定量反转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcriptase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR）进一步筛选验证可能参与萝卜硫素促进大脑类器官生长潜在基因或可能的靶点。
结果
加入萝卜硫素处理40 d的大脑类器官中性别决定区Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）、前脑标志蛋白叉头框G1（forkhead box G1，FOXG1）、前额叶皮质孤独症易感候选基因2（autism susceptibility candidate 2，AUST2）、配对盒基因6（paired box 6，PAX6）表达明显增强；加入萝卜硫素处理70 d大脑类器官中神经元标志蛋白神经元Ⅲ型β-微管蛋白（β-tubulin，TUJ1）、神经元核（neuronal nuclei，NeuN）、微管相关蛋白2（recombinant microtubule associated protein 2，MAP2）、T脑蛋白家族1（T-brain-1，TBR1）等表达增强。RNA测序分析显示，相比于对照组，实验组显著上调基因105个，下调基因512个，共617个。qRT-PCR验证差异表达基因（SFTPC、AKR1C3、CXCR6、PRAP1、TMC8、GPR182、F2RL2、KCNJ10）的转录水平与测序结果基本一致。
结论
差异表达基因AKR1C3、KCNJ10可能参与萝卜硫素促进大脑类器官前额发育和神经元分化，这有助于为萝卜硫素改善精神疾病和神经退行性疾病患者的认知和症状提供证据支持。
萝卜硫素（sulforaphane）是一种异硫氰酸盐，由硫代葡萄糖苷（glucosinlate）经植物体内黑芥子酶（myrosinase enzyme）水解所得［1］。作为一种常见的抗氧化剂，萝卜硫素在花椰菜、甘蓝、羽衣甘蓝和芽甘蓝、水芹等十字花科蔬菜中含量较为丰富，是蔬菜中所发现的抗癌效果最好的植物活性物质之一［2, 3］。自1948年发现以来，这种硫代葡萄糖苷被频繁研究，并显示出多种生物效应，包括抑制氧化应激、抗炎、抗菌、抗癌、抗衰老、神经保护和抗糖尿病［4, 5］。近年来研究显示，萝卜硫素能够改善大鼠及小鼠学习记忆功能障碍，在阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）、帕金森病、抑郁症、精神分裂症、自闭症等疾病的认知功能改善中起重要作用［6, 7, 8］。
大脑类器官是由人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，HiPSCs）定向诱导分化形成的类似大脑早期发育过程中的皮质结构［9, 10］。其由Lancaster等［11］在2013年建立，能较好地反映人体早期胚胎期大脑的发育过程。RNA测序显示，培养至第40天的大脑类器官与孕9周的人类胎儿大脑标本的基因表达谱十分相似，培养70 d的大脑类器官与孕中期的大脑基因表达谱类似，提示大脑类器官能够在一定程度上反映体内早期胚胎大脑的形成［12］。因此，大脑类器官可以作为一种有效的体外早期大脑发育模型，用于研究萝卜硫素对大脑发育的影响。与常用的神经细胞培养和动物模型相比，大脑类器官可以在一定程度上体外模拟人类大脑的发育过程和结构特点，并能较好地保持人体特异性的基因型和蛋白表达水平，目前广泛用于模拟神经发育、感染性和神经精神疾病的病因学和病理过程中［13, 14, 15, 16］。
我们使用萝卜硫素处理HiPSCs分化形成的大脑类器官，通过比较不同时期大脑类器官脑区分化和神经细胞标志物的改变，探讨萝卜硫素对大脑类器官发育的影响；并进一步进行转录组学研究及相关生物信息学分析，进一步探索萝卜硫素影响大脑类器官的可能机制。
材料和方法
一、材料
本研究为干预性研究，研究起止时间为2020年10月至2021年10月。
实验细胞和主要试剂：HiPSCs细胞系购自北京赛贝生物技术有限公司（货号CA4024106、CA4025106及CA4028106），Matrigel工作液（美国Corning公司），HiPSCs细胞培养使用mTeSR™1培养基（美国STEM CELL公司），大脑类器官培养使用STEMdiff™ Cerebral Organoid Kit培养基（美国STEM CELL公司），萝卜硫素（美国Selleck公司），抗体：八聚体转录因子4（ecombinant octamer binding transcription factor 4，OCT4；美国GENE TEX公司）和阶段特异性胚胎抗原4（stage-specific embryonic antigen 4，SSEA4；美国GENE TEX公司），Ki-67（英国Abcam公司）和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspas-3；英国Abcam公司）、前脑标志蛋白叉头框G1（forkhead box G1，FOXG1；英国Abcam公司）、海马的标志蛋白卷曲蛋白9（Frizzled 9，英国Abcam公司）、神经干细胞标志蛋白性别决定区Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2；美国Cell Signaling公司）、类脑室结构标志蛋白N-钙黏蛋白（N-cadherin；美国Cell signaling公司）、前额皮质标志蛋白孤独症易感候选基因2（autism susceptibility candidate 2，AUTS2；美国Proteintech公司）、神经元和皮质发育标志蛋白配对盒基因6（paired box 6，PAX6；英国Abcam公司）、深层皮质标志物T脑蛋白家族1（T-brain-1，TBR1；英国Abcam公司），少突胶质细胞系转录因子2（recombinant oligodendrocyte lineage，OLIG2；英国Abcam公司）和神经细胞标志蛋白神经元Ⅲ型β-微管蛋白（β-tubulin，TUJ1；美国cell signaling公司）、微管相关蛋白2（recombinant microtubule associated protein 2，MAP2；英国Abcam公司）、神经元核（neuronal nuclei，NeuN；英国Abcam公司）及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP；美国Cell Signaling公司）等。二抗：山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗、山羊抗鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗和山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗（均为美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，AG11711）。
采用完全随机化进行分组，实验组为不同浓度（1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L）萝卜硫素处理组，对照组为空白对照组，每组20个类器官。
本研究方案经过中南大学湘雅二医院伦理委员会批准，批号为：2021723。
二、方法
1.大脑类器官的培养：在培养HiPSCs细胞时，提前利用Matrigel工作液进行细胞培养皿的铺底预处理，使用mTeSR™1进行HiPSCs细胞培养。将mTeSR™1培养基中的HiPSCs添加到低粘附96孔板的每个孔中，每个孔加入STEMdiff™ Cerebral Organoid Kit培养基，放入37 ℃的培养箱（5%CO2，21%O2）中培养，形成拟胚体。第5天，将形成的拟胚体转移到低粘附24孔板中并培养2 d，形成中心较黑，边缘清晰光滑的神经外胚层。第8天，将组织包埋在Matrigel胶中并转移至低粘附6孔板中。第10天，组织周围神经上皮芽突出现，将培养皿转移至培养箱中的摇床上，震荡培养，同时更换成类器官成熟培养基进行长期培养。于第8天将不同浓度（1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L）的萝卜硫素添加至培养皿中，分别培养至40 d、70 d。每天在显微镜下检查HiPSCs、拟胚体、神经外胚层、神经上皮组织和大脑类器官的形态和生长情况，并通过荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，型号BX51）在明亮视野下成像。
2. 苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE）与免疫荧光染色：大脑类器官用4%多聚甲醛固定、脱水、透明、石蜡浸泡和石蜡包埋后进行下一步切片操作。染色时，首先将切片置于60 ℃烘箱中1 h熔化石蜡，随后置于二甲苯的溶液中浸泡，然后用不同梯度酒精处理后在微波炉中进行抗原修复（柠檬酸钠，pH=6.0）。滴加山羊血清封闭液，室温封闭1 h后加一抗4 ℃过夜孵育。第2天在标本上滴加荧光素标记的二抗，室温孵育30 min至1 h，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI）染色10 min，用防淬灭荧光剂封片。
HE染色：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，使用苏木精染料进行染色，流水稍洗去染料，再用0.1%盐酸乙醇进行分化，然后用伊红液染色，染色完成后用流水洗去多余染料，水洗完染料后用从低到高浓度的酒精进行醇洗以及脱水，使用二甲苯进行透明，树脂进行封片。
3.RNA测序：对使用1 μmol/L萝卜硫素处理后第40天的实验组和对照组大脑类器官同时进行RNA测序，每组3个样品。利用真核生物大部分信使RNA（messenger RNA，mRNA）都带有多聚核苷酸（polynucleotides，PolyA）尾的结构特征，通过Oligo（dT）磁珠（美国Thermo公司）富集带有Poly A尾的mRNA，随后在限制性内切酶（NEB）RNA文库准备工具包中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断，按照NEB普通建库方式或链特异性建库方式进行建库。测序的核心是基因表达差异的显著性分析，采用统计学方法比较2个条件或多个条件下的基因表达差异，从中找出与条件相关的特异性基因，然后进一步使用IPA软件（Qiagen公司）对每组的mRNA丰度进行生物信息学评估。差异基因的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析和基因本体论（Gene Ontology，GO）分析：KEGG是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。KEGG通路富集以Padj<0.05作为显著性富集的阈值。GO是描述基因功能的综合性数据库，可分为生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）、分子功能（molecular function）3个部分。GO功能富集以Padj<0.05作为显著性富集的阈值。基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）：是一种针对全基因组表达谱芯片数据的分析方法，将基因与预定义的基因集进行比较。即综合现有的对基因的定位、性质、功能、生物学意义等信息基础，构建一个分子标签数据库，在此数据库中将已知基因按照染色体位置、已建立基因集、模序、肿瘤相关基因集和GO基因集等多个功能基因集进行分组与归类。通过分析基因表达谱数据，了解其在特定的功能基因集中的表达状况，以及这种表达状况是否存在统计学意义。GSEA不需要指定明确的差异基因阈值，把基因按照在2组样本中的差异表达程度进行排序，然后采用统计学方法检验预先设定的基因集合是否在排序表的顶端或低段富集。GSEA主要包括3个步骤：计算富集得分（enrichment score），估计富集得分的显著性水平，多重假设检验。
4.实时定量反转录PCR（real-time quantitative reverse transcriptase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR）验证：通过二代测序结果，选取实验组和对照组变化倍数4倍以上且具有显著性的进行qRT-PCR的验证，选出比较显著基因。使用RNAfast200试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）提取2个不同细胞株萝卜硫素与对照组大脑类器官（每个样品3个复孔）的总RNA，NanoDrop2000微量分光光度计（美国Thermo公司）测定RNA浓度，使用反转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA，在LightCycler 480（罗氏公司）通过实时荧光定量PCR法对基因表达进行相对定量分析。
三、统计学处理
免疫染色图像使用Image Pro Plus 6.0进行细胞计数。利用GraphPad Prism 8软件进行免疫荧光不同基因图像及qRT-PCR基因表达量统计，数据采用均数±标准差表示，采用t检验比较2组免疫荧光细胞数及qRT-PCR基因表达量，P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。生物信息学分析采用R语言软件筛选差异基因，然后使用IPA软件进行GO、KEGG及GSEA分析。
结果
一、萝卜硫素促进大脑类器官生长
HiPSCs在正常干细胞培养条件下集落样生长，并表达多能干细胞标记OCT4、SSEA4、Ki-67和Caspas-3。在干细胞定向分化过程中，HiPSCs逐步分化形成拟胚体、第8天左右形成神经外胚层、第10天左右形成神经上皮组织，长期培养的大脑类器官其组织形状迅速增大，并分化形成不同脑区结构（图1A）。HiPSCs定向分化形成的3D大脑类器官能在一定程度上模拟人类胎儿大脑发育进程。在大脑类器官分化的神经外胚层阶段加入不同浓度的萝卜硫素进行处理，相比于对照组，实验组显示出较快的生长速度。HE染色示加入萝卜硫素40 d左右出现明显的生长，培养70 d后实验组体积相对于对照组明显增大，结构更加完整；见图1B及图2。
图1 1 μmol/L浓度萝卜硫素处理后不同时间点实验组（n=3）和对照组（n=3）大脑类器官的生长情况
图2 不同浓度萝卜硫素处理后的实验组（n=3）与对照组（n=3）40 d和70 d大脑类器官生长情况 HE 染色
二、萝卜硫素促进大脑类器官前额发育和神经元分化
免疫荧光染色示培养40 d后，2组类器官中各个脑区标志物如前脑标志物FOXG1、脑室样结构标志物N-cadherin、前额叶皮质AUST2和海马常见标志物Frizzled 9均出现表达，前脑、脑室样结构、前额叶皮质和海马样结构形成。与对照组大脑类器官比较，加入萝卜硫素处理（1 μmol/L）40 d的大脑类器官中可见前脑标志蛋白FOXG1、神经元和皮质发育标志蛋白PAX6、前额叶皮质AUST2、神经干细胞标志蛋白SOX2表达明显增强（图3）。在培养70 d的大脑类器官中，加入不同浓度萝卜硫素处理后，大脑类器官中深层皮质标志物TBR1，神经元标志蛋白TUJ1、NeuN、神经微管MAP2表达增强（图4）。大脑类器官细胞类型标志物TUJ1/GFAP的比例40 d为0.55，70 d为2.57，70 d时神经元的表达比胶质细胞更多。
图3 1 μmol/L浓度萝卜硫素处理40 d实验组与对照组大脑类器官SOX2、PAX6、FOXG1、AUST2表达增强 免疫荧光染色
图4 1 μmol/L浓度萝卜硫素处理70 d实验组（n=3）与对照组（n=3）大脑类器官TBR1、TUJ1、NeuN、MAP2表达增强 免疫荧光染色
三、基因测序生物信息分析
1.差异基因筛选：使用R语言edgeR包筛选出符合条件的差异基因（以log2为底计算样本间表达量的差异倍数值≥ 2或以log2为底计算样本间表达量的差异倍数值≤-2，P<0.05）。相比于对照组，1 μmol/L萝卜硫素处理实验组基因上调105个，基因下调512个，共617个（图5）。
图5 1 μmol/L萝卜硫素处理实验组（n=3）与对照组（n=3）差异基因的火山图
2.差异基因的KEGG和GO分析：KEGG分析显示排名前10 的主要影响通路见图6。在GO通路中萝卜硫素对神经元形态构建、突触连接起着重要作用，详见图6。
图6 实验组（n=3）与对照组（n=3）大脑类器官差异表达基因在KEGG及生物过程、细胞组分和分子功能属性方面的GO分析
3.GSEA分析：加入萝卜硫素测序GSEA富集分析时发现的具有代表性疾病和生物功能基因集：（1）细胞发育（如细胞增殖、神经元和突触发育、轴索形成和神经系统分化）；（2）神经发育和功能（如大脑形态、神经元迁移、轴突分支和形态以及长期突触抑制）；（3）神经疾病（如认知功能障碍、缺血性中风、癫痫发作、神经障碍）；（4）细胞间信号和相互作用（如神经传递、电位和突触组织）；（5）心理障碍（如焦虑、智力迟钝、言语和语言障碍、抑郁）。GSEA富集分析中基因表达较强的富集图：大脑皮质放射状细胞迁移基因集（GO：0021799），线粒体生物发生的转录激活基因集（R-HSA-2151201）、NOTCH信号通路基因集（HSA04330）、脑神经疾病基因集（DOID：5656）、组蛋白H4乙酰化基因集（GO：0043967）；见图7。
图7 实验组（n=3）与对照组（n=3）大脑类器官差异表达基因GSEA分析
4. qRT-PCR验证差异性表达基因：通过qRT-PCR分析差异表达基因在大脑类器官中的表达情况，验证的差异表达基因及其引物序列见表1。结果显示，与对照组大脑类器官相比，SFTPC、AKR1C3、CXCR6、PRAP1、TMC8、GPR182、F2RL2、KCNJ10基因变化趋势与测序结果一致，其转录水平上调，差异有统计学意义（图8）。
图8 qRT-PCR验证实验组（n=3）与对照组（n=3）在基因表达转录水平差异有统计学意义
讨论
我们对不同浓度萝卜硫素处理的HiPSCs来源的大脑类器官模型进行研究，探索萝卜硫素对大脑类器官生长的影响及可能的相关信号通路，研究结果显示萝卜硫素对大脑类器官在组织、细胞和基因表达水平上有一定的促进生长和分化作用。萝卜硫素处理大脑类器官40 d，实验组与对照组相比，其前额叶皮质、前脑、神经干细胞标志蛋白表达明显增强；70 d时，实验组较对照组神经元表达明显增强。生物信息学分析表明，萝卜硫素对大脑类器官的促进作用可能与神经元形态构建、突触连接有关。
精神疾病等神经发育障碍相关疾病的发病机制有神经元可塑性受损、神经发生障碍和神经元死亡［15, 16, 17］。神经发生是一个重要的生物学过程，发生在成人大脑的脑室下和颗粒下区［18, 19, 20］。动物实验也证实长期服用萝卜硫素治疗AD模型鼠可防止脑室下和颗粒下区BrdU神经元数量减少，延缓AD的进程［21］。同样Hou等［22］发现萝卜硫素治疗可逆转AD（PS1V97L）转基因小鼠的空间认知和学习记忆功能障碍，表明神经细胞增殖可能是萝卜硫素改善AD相关记忆和认知功能障碍的关键。Han等［23］及Zanichelli等［24］研究发现，低浓度萝卜硫素给药可增强神经干细胞中β-连环蛋白和细胞周期蛋白D1的表达，并促进人类间充质干细胞增殖。最近的1项动物实验显示膳食摄入萝卜硫素可防止母体免疫激活后，成年后代内侧前额叶皮质中免疫反应性的丧失及认知缺陷［25］。在原代培养的皮质神经元中，萝卜硫素（10 μmol/L及20 μmol/L）处理也可增强脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、MAP2、环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1 and 2，ERK1/2）和蛋白激酶B（Akt）的表达［26］。其机制可能是萝卜硫素通过对组蛋白去乙酰化酶的抑制从而增强了BDNF-TrkB的信号传导，具有保护神经元的作用。
萝卜硫素可能通过促进前额分化，增强神经发生、增加神经元的数量等促进大脑类器官生长。本研究中我们分析了全基因组的基因表达，对于1 μmol/L萝卜硫素干预的大脑类器官分析发现27 442个mRNA中有617个基因显著改变。内向整流型钾离子通道亚家族J成员10（KCNJ10）是一种蛋白质编码基因，编码的蛋白质可能与另一种钾通道蛋白形成异二聚体，并可能负责大脑中神经胶质细胞的钾离子活动。外侧缰核神经元的爆发活动增强易导致抑郁样行为，外侧缰核中星形胶质细胞特异性钾离子的增加或减少可能会调节神经元凋亡及抑郁症状，同时胶质细胞-神经元相互作用可能会导致重大精神疾病模型中神经元的放电模式异常［27］。那么萝卜硫素可能会通过影响神经胶质细胞钾离子活动改善神经元的异常。AKR1C3是基因编码醛/酮还原酶（aldo-keto reductase，AKR）超家族的成员，该超家族由40多种已知的酶和蛋白质组成。这些酶通过利用还原型辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）作为辅因子催化醛和酮转化为其相应的醇。神经类固醇是由胆固醇或类固醇前体在脑和外周类固醇生成组织中合成的，它与神经增殖、分化和活动有关。但只有AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3在大脑中表达。Quast等［28］发现焦虑与位于AKR1C1基因中的2个内含子SNP（rs3930965、rs41314625）显著相关，因此可以进一步探究萝卜硫素是否通过影响AKR1C3的表达达到临床改善认知的作用。
萝卜硫素可能在细胞功能、通讯、发育和神经疾病通路中形成调节网络，在神经干细胞增殖、神经发生、突触发生、细胞迁移和网络连接中起着关键作用。本研究有一定的局限性：大脑类器官虽然来源于HiPSC，能部分模拟人类脑发育过程，并进行药理实验，但无法模拟行为学和认知评估。进一步实验需使用神经发育障碍或者精神疾病患者来源的大脑类器官，使用萝卜硫素进行处理，结合患者的临床表现及认知情况，进一步明确相关机制。
综上所述，本研究显示萝卜硫素促进大脑类器官前额发育和神经元分化，并且我们探讨了其中潜在的分子和细胞机制。这项研究有助于为萝卜硫素在改善精神疾病和神经发育障碍患者的认知及症状提供证据支持。
参考文献（略）
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